培養(yǎng)細胞需注意哪些小細節(jié)?

　　培養(yǎng)細胞就像養(yǎng)育孩子一樣，要精心照料，用心呵護。每天都去看看它們，滿足它們所需要的物質(zhì)需求，防止出現(xiàn)培養(yǎng)箱缺水、二氧化碳不足、溫度不夠等各種小意外，還要注意很多小細節(jié)，以免開展重復(fù)的實驗導(dǎo)致不必要的人力物力浪費。

　　那培養(yǎng)細胞都要注意哪些小細節(jié)呢?就讓我們一起來看看吧!

　　1.細胞生長的營養(yǎng)來源

　　不同的細胞的培養(yǎng)基是不相同的，對于大多數(shù)腫瘤細胞來說，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基(DMEM、RPMI1640、MEM等)和10%胎牛血清(FBS);為了防止污染，可以適時加1%雙抗，抗生素的使用應(yīng)為短期。

　　Q：細胞培養(yǎng)基配方如何選擇?

　　A:
一般購買細胞時，針對不同的細胞株，會有詳細的介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源肺癌細胞A549可用DMEM培養(yǎng)基，在胎牛血清的選擇上也可以選用來源可靠的胎牛血清，能提供較好的營養(yǎng)成分，以滿足細胞株生長的需要。

　　Q：如果細胞生長緩慢，需要增加血清比例嗎?

　　A：可以。

　　2.細胞生長的環(huán)境

　　舒適無菌的環(huán)境是細胞健康生活的重要基礎(chǔ)。需要合適的器皿，不同形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等，最終進入合適的恒溫箱培養(yǎng)，如腫瘤細胞就需37℃，5%CO2的恒溫箱中生長。

　　Q：細胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶如何選擇?

　　A：根據(jù)不同的應(yīng)用選擇不同的培養(yǎng)皿或容量板，如MTS用96孔板，細胞爬片用24孔，流式分析用6空等

　　而選擇培養(yǎng)皿還是選擇培養(yǎng)瓶，就細胞培養(yǎng)狀態(tài)來說差別不大，主要是培養(yǎng)瓶的安全系數(shù)更高一些，數(shù)量也會大一些，但是成本也相對較高，因此沒有特殊要求時，一般用培養(yǎng)皿即可。

　　Q：血清是否要滅活處理，保證環(huán)境無菌?

　　A：這取決于您的應(yīng)用。

　　滅活過程中，會導(dǎo)致血清中某些成分被破壞，如氨基酸，維生素，生長因子等。所以只有在您的實驗對血清有特殊要求時，才會考慮對血清進行滅活處理。如您的實驗對血清中的某種組分敏感，需要去除該組分。最常見的情況是需要去除血清中的補體蛋白，因為補體在機體中參與細胞殺傷，巨噬細胞和淋巴細胞活化，肥大細胞和血小板組胺釋放，平滑肌收縮等過程，所以一般在免疫學相關(guān)研究中及肌細胞和干細胞的培養(yǎng)過程中需要對血清進行滅活處理。

　　3.細胞復(fù)蘇與凍存

　　細胞復(fù)蘇是指將凍存的細胞解凍之后再重新培養(yǎng)，細胞從冷凍停止生長狀態(tài)恢復(fù)生長的過程。

　　Q：細胞復(fù)蘇后，為什么很多難以貼壁?

　　A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-5～0℃)。

　　細胞凍存則是將細胞放在低溫(-70℃~196℃)環(huán)境，降低細胞內(nèi)的代謝活動，最/大限度的保存細胞活力，以便長期存儲。

　　Q：目前細胞凍存液多采用的什么配方?

　　A：目前細胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護劑，細胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。

　　4.細胞的傳代培養(yǎng)

　　細胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿空間有限，細胞過密生長就會受到抑制，影響細胞的狀態(tài)，因此我們要把細胞中的一部分分到別的培養(yǎng)皿里，這樣細胞才能生長的好。

　　Q：細胞傳代培養(yǎng)為什么要選擇對數(shù)期細胞?

　　A:
細胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期(指數(shù)期)，平穩(wěn)期(平臺期)和衰退期。為了確保活力，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細胞保持在對數(shù)期。一般細胞長到70%~80%左右就可以傳代了。

　　除了上述幾個環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)問題外，細胞培養(yǎng)還有很多小問題如下：

　　Q：培養(yǎng)基多久換一次?

　　A:
正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細胞，建議隔天換液。

　　Q：血清應(yīng)如何融解?

　　A：從冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化過程中不時旋轉(zhuǎn)(swirling mix)混勻。充分融解后分裝或平衡到室溫后使用。

　　Q：如果細胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理?

　　A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。

　　Q：血清中出現(xiàn)絮狀沉淀是否需要去除?如何去除?

　　A：多種原因可能導(dǎo)致絮狀沉淀的形成，最常見的原因之一是融化過程中，脂蛋白聚集所致。該現(xiàn)象一般不會影響產(chǎn)品質(zhì)量。可以400g離心5分鐘，取上清，然后過濾。根據(jù)需要選擇合適的濾膜孔徑，一般常用的是0.22um
PES材質(zhì)的濾膜。為避免濾膜阻塞，建議離心后取上清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾而不是直接過濾血清。

　　總之，細胞培養(yǎng)是后續(xù)實驗的基石，留心各種細節(jié)問題，嚴守滅菌處理的程序，保護好自己養(yǎng)的細胞，這樣才能快樂地進行后續(xù)的實驗。